Нелинейна доза-реакция на алуминиеви хидроксидни частици: Селективна невротоксичност при ниска доза

алуминиеви адюванти

алуминиеви адюванти Автори: Crépeaux G, Eidi H, David MO, Baba-Amer Y, Tzavara E, Giros B, Authier FJ, Exley C, Shaw CA, Cadusseau J, Gherardi RK.

Резюме

Алуминиевият (Аl) оксихидроксид (Alhydrogel®), основното адювантно средство във ваксините за хора и животни, се състои от първични наночастици, които спонтанно се смесват. Интересът по отношение на неговата безопасност се появява след приемане на факта за неочаквано дълготрайното му запазване в имунните клетки при някои индивиди и съобщенията за синдром на хроничната умора, когнитивна дисфункция, миалгия, дизавтономия и автоимунни/възпалителни признаци, временно свързани с множество ваксини, съдържащи Аl . Експерименти с мишки са документирали улавянето и бавното му транспортиране от моноцитни клетки от инжектирания мускул до лимфоидните органи и в крайна сметка в мозъка. Настоящото изследване е насочено към оценка на мозъчната дейност на мишката и концентрация на алуминий 180 дни след инжектиране на различни дози Alhydrogel® (200, 400 и 800 μg Al/kg телесно тегло) в предния мускул при възрастни женски CD1 мишки. Когнитивните и моторни характеристики бяха оценени с 8 валидирани теста, микроглиална активация с Iba-1 имунохистохимия и атомно-абсорбционна спектроскопия с графитна пещ на Аl ниво.

Наблюдаван е необичаен невротоксикологичен модел, ограничен до ниска доза Alhydrogel®. Установени са невроповеденчески промени, включително понижени нива на активност и подобно на тревожност променено поведение при животните, които са изложени на 200 μg Al/kg, но не и при онези, изложени на 400 и 800 μg Al/kg. Постоянно се наблюдава увеличение на микроглиалното число в предния мозък при групата с инжектирани 200 μg Al/kg. Нивата на Al в мозъка са селективно повишени при животни, изложени на най-ниската доза, докато мускулните грануломи са почти напълно изчезнали след 6 месеца при тези животни.

Ние заключаваме, че Alhydrogel®, инжектиран мускулно в ниска доза при мишки, може избирателно да индуцира дългосрочно натрупване на алуминий в мозъка и да има невротоксични ефекти. Обяснението на този неочакван резултат може да бъде използвано в бъдещи изследвания и е свързано с размера на частиците адювант, тъй като единствено и само инжектираните суспензии с най-ниска доза алуминий, но не и онези с най-високата, съдържат малки агломерати с размери на бактерии, които успешно биват уловени и както се предполага, транспортирани от моноцитни клетки. Във всеки случай мнението, че невротоксичността на Alhydrogel® се подчинява на валидното за класическата химична токсичност правило „дозата прави отровата“, изглежда прекалено опростено.

Дискусия

В настоящото изследване 8 широко използвани поведенчески тестове, проведени 180 дни след мускулни инжекции от 200, 400 или 800 μg Al/kg под формата на Alhydrogel® при възрастни женски CD1 мишки, показват един важен ефект при животните, изложени на най-ниската доза. Животните, инжектирани с 200 μg Al/kg, показват понижени нива на локомоторна активност, оценени чрез понижена способност за изминаване на общо разстояние на открито, както е съобщено по-рано след подкожно инжектиране на 100 и 300 μg Al/kg Alhydrogel® (Petrik et al. Shaw and Petrik, 2009), като едновременно с това има понижение в теста за сила на захващане, което предполага умерена двигателна слабост. В допълнение, увеличава се прекараното в централната област време, едновременно с намаляване на изминатото разстояние и прекараното в периферната зона време, което сочи промяна в поведението, оказващо влияние върху защитната реакция на гризачите за предпазване от открити пространства (Bourin et al., 2007), докато други проучвания съобщават за повишени нива на безпокойство (Petrik et al., 2007; Agmon-Levin et al., 2014). За разлика от това, най-високите дози от 400 и 800 μg Al/kg не причиняват такива промени. В съответствие с променените поведенчески реакции, гъстотата на микроглиалните клетки изглежда значително увеличена при животни, изложени на 200 μg Al/kg. Тази слаба церебрална присъща имунна активация е селективно наблюдавана в предната част на мозъка, включващ амигдалоидните ядра, които са отговорни за подобно на безпокойство/тревожност поведение (LeDoux, 2007). Освен това, нивата на алуминий в мозъка са значително повишени при животни, инжектирани с 200 μg Al/kg, но не и при инжектираните с 400 и 800 μg Аl/kg дози, които не показват нито невроповеденчески изменения, нито микроглиални реакции. Увеличеното ниво на алуминий в мозъка се свързва с почти пълно изчезване на алуминиево-индуцирания гранулом (на инжекционното място) при получили 200 μg Al/kg мишки, докато при инжектираните с 400 или 800 μg Al/kg постоянно се откриват грануломи в мускулите. В допълнение към очевидното образуване на гранулом, 2/6 от тези животни имат псевдо-лимфоматозна изява, което предполага необичайно силна локална имунна реакция към чуждия материал.

В настоящото изследване не се оценява концентрацията на Al в други тъкани като кръв. В действителност, като се използва изотоп 26Al, както сочат предходни опити, максималното увеличение на Al в плазмата в рамките на 28 дни след мускулно инжектиране на алуминиев хидроксид при заек, е около 2 ng/mL. Тъй като нормалната концентрация на Al е около 30 ng/mL при животното, се казва, че такова малко увеличение не би било отразено, ако не са използвани адюванти 26Al (Flarend et al., 1997). Така определянето на Al-нивото в плазмата в дългосрочен план, т.е. 6 месеца след мускулно инжектиране, не може да ни предостави информация при нашите мишки. Освен това предложеният метод в настоящото изследване, при който Al се транспортира до органи и тъкани, които са отдалечени от мястото на инжектиране, всъщност не включва разтварянето на алуминиевия адювант в мускулната интерстициална течност и след това в кръвта, но предполагаме, че се извършва транспортиране на значителни количества Al в тези клетки, които са инфилтрирали мястото на инжектиране и са поели Al чрез ендоцитоза. Като се имат предвид измерванията на Al в мускулните биопсии, смятаме, че те няма да разграничават извънклетъчния и вътреклетъчния Al.

Доказването на кривата на нелинейна доза-реакция на невротоксичните ефекти на Alhydrogel® със селективна токсичност на най-ниската доза – тема на изследването, подлага на съмнение класическата токсикологична парадигма „дозата прави отровата“. Немонотонни криви на доза-реакция са докладвани и по-рано в областта на алуминиевата токсикология. Немонотонни двуфазни невротоксични ефекти са наблюдавани както в in vitro изследвания (вж. Exley and Birchall, 1992; Platt et al., 1995; Eidi et al., 2015), така и при in vivo (Kumar 1998; Tsunoda and Sharma, 1999; Kim, 2003; Roig et al., 2006) след перорално приложение на Al. Кривата на дозата-реакция на настоящото проучване обаче не е двуфазна. Освен това, тъй като нивото на церебралния алуминий не е повишено при мишки, инжектирани с 400 или 800 μg А1/kg, наблюдаваната липса на невротоксичност при тези високи дози вероятно се дължи на ограничената мозъчна транслокация на Al, а не на нейните парадоксални цитотоксични ефекти върху нервните клетки. Този загадъчен резултат е предизвикателен при отсъствието на солидни познания за фармакокинетиката на Alhydrogel®. Преди това проучихме съдбата на алуминиеви частици след мускулна инжекция. Алуминиевият хидроксид е силно хидратирано кристално съединение, съставено от елементарни нано-игли с приблизително 2.2 nm × 4.5 nm × 10 nm (Mao et al., 2013) и показва фиброзна морфология при трансмисионна електронна микроскопия (Shirodkar et al., 1990; Eidi et al., 2015). Това съединение спонтанно образува агломерати с размер на микрон (Johnston et al., 2002), като размерът леко се изменя след адсорбцията на антиген (Eidi et al., 2015) и in vivo взаимодействието с фосфатна, органична и белтъчна среда. Серия от неотдавнашни доклади на нашата лаборатория показват, че транслокацията на алуминиев хидроксид може да бъде специфично свързана с поемането на клетъчни линии от моноцити на това слабо биоразградимо съединение (Khan et al., 2013, Crépeaux et al., 2015, Eidi et al., 2015 ) вероятно в резултат на фагоцитоза или макропиноцитоза (Mao et al., 2013).

Скорошни проучвания предполагат, че адювантният ефект изисква поемане от дендритни клетки (Morefield et al., 2005) и комбинира:

  • локално регулиране на хемокини, включително CCL2 (MCP-1) и CCL3 (MIP-1α), което повишава количеството на имунните клетки в инжекционното място;
  • повишаване на поемането на антиген от вродени имунни клетки;
  • индуциране на моноцитната диференциация в дендритни клетки;
  • улесняване на миграцията на дендритни клетки към dLNs (дрениращите лимфни възли) за първични адаптивни имунни отговори (Seubert et al., 2008).

Макрофагите улавят бактерии, които обикновено са с диапазон от 1-4 μm (Kowalski et al., 1999). Предишен доклад показва, че експозицията in vitro на моноцитни THP1 клетки на Alhydrogel® 200 μg Al/mL води до клетъчно вграждане на агломерати на Alhydrogel®, чийто размер е 1,20 μm, измерен чрез трансмисионна електронна микроскопия след 24 часа (Mold et al., 2014, 2016). Съответно този диапазон на размера е показал, че е оптимален за поглъщане на частици от миши перитонеални макрофаги (1-2 μm) (Tabata and Ikada, 1988) и за прикрепване на частици и последващо усвояване от миши алвеоларни макрофаги (2-3 μm), а от друга страна значително намалява, когато размерът надвишава 4,2 μm (Champion et al., 2008).

Биоустойчивостта на Alhydrogel® е потвърдена в редица лабораторни животински модели до 6-12 месеца след инжектирането, както в инжектирания мускул (Verdier et al., 2005, Authier et al., 2006, Khan et al., 2013, Eidi et al., 2015), така и в отдалечени лимфоидни органи (Crépeaux et al., 2015). Транспортирането на частици от инжектираната тъкан в dLNs зависи от размера, като по-малките частици (20-200 nm) могат да се дренират в свободна форма, докато частици със среден размер (0.5-2 μm) са изключително подложени на клетъчен превоз (Manolova et al., 2008). Въпреки че тази тема не е разглеждана и описана точно за частици >2 μm, напълно възможно е бързото клетъчно поглъщане на частици с ограничен размер да е свързано с по-бърз клетъчен транспорт до dLNs в сравнение с това на големите частици, подложени на бавно усвояване от клетката, което сочи, че за един и същи период от време по-ниските дози адювант могат да се разпространят в тялото и да достигнат до мозъка, докато по-високите дози – не (Crépeaux et al., 2015).

На тези основания извършихме проучвателна оценка на размера на агломератите – параметър, който може да бъде модифициран, когато концентрацията на колоидната суспензия е увеличена, за да коригира дози (0.1, 0.2, 0.4 g Al/L в PBS 1X, съответстващи на 200, 400, и съответно 800 μg Al/kg). Динамичното разсейване на светлината показва, че колоидните суспензии в PBS при рН 7.2, съответстващи на невротоксичните 200 μg Al/kg условия, са съставени изключително от агломерати с малък размер на бактериите (средно = 1750 ± 100 nm), лесно захванати от вродените имунни клетки. За разлика от това, съответстващите на по-високи дози суспензии показват 2 пика на големината, включително един пик, съответстващ на много големи агломерати (около 35 000 nm), а другият съответства или на малки агломерати (средно = 1500 ± 400 nm при 400 μg Al/kg състояние) или средни агломерати (средна стойност = 4800 ± 500 nm при 800 μg Al/kg състояние).

Въпреки че са необходими ясни изследвания, за да се документира агломерационното влияние на Alhydrogel® върху in vivo невротоксичните ефекти, подобна находка няма да е безпрецедентна в областта на токсикологията на частиците, тъй като както клетъчното усвояване, така и разпределението в тялото на други видове частици, са повлияни от размера на частиците (Buzea et al., 2007; Reddy et al., 2007; Landsiedel et al., 2012) и степента на струпване (Mühlfeld et al., 2008) – два параметъра, които силно определят токсичността на частиците (Bell et al., 2014; Leclerc et al., 2012; Nascarella and Calabrese, 2012; Mold et al., 2016).

В заключение, профилът на описаната тук нелинейна доза-реакция, при която най-ниската доза, но не и най-високата доза, е невротоксична при мишки, е ново откритие в областта на безопасността на алуминиевите адюванти. Това може да подскаже, че токсичността на Alhydrogel® се подчинява на специфичните правила за токсикология на частиците, а не на опростената връзка доза-реакция. Като възможна последица, сравняването на експозиция на адювантна ваксина спрямо други несъществени алуминиеви приеми, например разтворим алуминий и други пътища на експозиция, може да се окаже невалиден подход. Например степента на задържане на алуминий, наблюдавана след интравенозно инжектиране на проследим разтворим алуминиев цитрат (Priest, 2004), е използвана за създаване на успокояващ модел за задържане на алуминиевите адюванти при бебета (Mitkus et al., 2011). Този модел се основава на хипотезата, че алуминиевите адюванти се разтварят от цитратните йони в мускулната интерстициална течност (Flarend et al., 1997), без да се взема предвид бързото адювантно клетъчно усвояване и системното дългосрочно разпространение на адювантните агломерати (Khan et al. 2013, Eidi et al., 2015). В контекста на масовото разрастване на ваксино-базирани стратегии в световен мащаб, настоящото изследване може да подскаже, че токсикокинетиката и безопасността на алуминиевите адюванти изискват преоценка.


Източник:
Crépeaux G, Eidi H, David MO, Baba-Amer Y, Tzavara E, Giros B, Authier FJ, Exley C, Shaw CA, Cadusseau J, Gherardi RK. Non-linear dose-response of aluminium hydroxide adjuvant particles: Selective low dose neurotoxicity. Toxicology. 2017 Jan 15;375:48-57. doi: 10.1016/j.tox.2016.11.018. Epub 2016 Nov 28.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300483X16303043

Свързани публикации